Przejdź do głównej treści
Wersja kontrastowa
en English Menu

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

APARATURA

Automatyczny, modułowy, fluorescencyjny mikroskop odwrócony Leica DMi8

Mikroskop Leica DMi8 wyposażony w oświetlacz LED (CoolLED pE-4000), system stabilizacji ostrości (AFC), dwie kamery i w pełni zmotoryzowany stolik. Pakiet oprogramowania pozwala m.in. na skanowanie preparatu (Navigator), jak i nagrywanie filmów poklatkowych (Timelaps). Mikroskop przede wszystkim dedykowany jest do pomiarów migracyjnych oraz sygnalizacji jonowej w czasie rzeczywistym. Doraźnie wykorzystywany jest do archiwizacji preparatów histologicznych.

Automatyczny mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000B wersja AF7000

Automatyczny  mikroskop fluorescencyjny umożliwiający oprócz aplikacji opisanych dla mikroskopu Leica DM IRE2 również szybkie pomiary ratiometryczne oraz  wykorzystanie technik FRET i TIRF. W szczególności mikroskop posiada:

  • obiektywy suche: 10x, 20x, 40x oraz z immersją olejową: 40x, 63x, 100x
  • wyposażenie do technik fluorescencyjnych, kontrastu IMC, DIC i PH (dla wybranych obiektywów)
  • metalohalogenkowy oświetlacz fluorescencyjny EL 6000
  • dwie cyfrowe chłodzone kamery CCD (12-bitowa Leica DFC360 FX i 14-bitowa  Hamamatsu 9100-02 EM-CCD High Speed Set)
  • zmotoryzowany stolik skanujący
  • komorę środowiskową z dodatkową nakładką do kontroli CO2 wraz z dedykowanymi modułami sterującymi
  • filtry fluorescencyjne wąskopasmowe (m.in.: A4; L5; N2.1; Y5; TxRed; RHOD-ET; GFP-ET, CFP, YFP)
  • filtr trójpasmowy: UV, niebieski, zielony, z wąskopasmowymi filtrami emisyjnymi: BP 465/20, BP 530/30 i BP 640/40 do układu IFW
  • wyposażenie do szybkich technik FRET i FURA2 (na który składają się odpowiednie kostki i szybkie koła filtrowe)
  • wyposażenie do techniki TIRF (w tym zestaw laserów diodowych i dedykowane kostki filtrowe umożliwiające obrazowanie wszystkich popularnych fluorochromów)
  • pasywny stół antywibracyjny
  • system komputerowy, dwumonitorowy z oprogramowaniem do kompleksowej kontroli mikroskopu, rejestracji poklatkowej w wielu polach widzenia, obrazowania 3D i późniejszej dekonwolucji rejestrowanych obrazów

Automatyczny mikroskop fluorescencyjny Leica DM IRE2

Automatyczny mikroskop fluorescencyjny Leica DM IRE2 wyposażony w cyfrową chłodzoną kamerę CCD umożliwiający m.in. akwizycję obrazu w trybie „time-lapse" z możliwością dowolnego projektowania przez użytkownika trybu pracy (ustawianie parametrów pracy kamery, otwierania i zamykania migawek, zmian filtrów, ustawiania odstępów czasowych, zmiany położenia stolika zarówno w płaszczyźnie xy jak i z, możliwość prowadzenia rejestracji obrazów z kilku miejsc preparatu w czasie jednej sekwencji). Oprogramowanie zarządzające systemem pozwala jednocześnie na akwizycję obrazów mikroskopowych w trybie „z-stack" i złożone operacje na plikach graficznych, w tym ich dekonwolucję (dekonwolucja w oparciu o funkcje rozproszenia - ang. point-spread function – PSF - wyliczaną przez program lub uzyskaną w wyniku pomiaru przez użytkownika), dynamiczne sekcjonowanie preparatów, pomiary i analizę obiektów dwu- lub trójwymiarowych (określenie powierzchni, kształtu, obwodu, położenia obiektu, parametry fotometryczne obiektu– sumaryczne i średnia wartość pikseli z analizowanego regionu itp.)  

Mikroskop Olympus IX81 wyposażony w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV

Częściowo zmotoryzowany mikroskop Olympus IX-81 jest wyposażony w lampę rtęciową i zestaw podstawowych filtrów do fluorescencji (emisja w zakresie światła niebieskiego, zielonego oraz czerwonego). Optyka mikroskopu jest dodatkowo wzbogacona w kontrast fazowy co umożliwia m.in. krótkotrwałe przyżyciowe obserwacje komórek niewybarwionych. Dzięki wyposażeniu mikroskopu w kolorową kamerę o uniwersalnych właściwościach, możliwe jest archiwizowanie obrazów uzyskanych metodami wymienionymi powyżej, jak też wykonywanie zdjęć preparatów histologicznych. Całość ułatwia specjalistyczne oprogramowanie, które odpowiada nie tylko za obsługę mikroskopu, ale też wstępną obróbkę uzyskanych obrazów, ich dowolne nakładanie, jak też podstawowe pomiary ilościowe.

Zestaw składa się z wykonanej na zamówienie komory perfuzyjnej, systemu perfuzji grawitacyjnej wraz ze statywem oraz systemu aspiracyjnego wraz z pompą próżniową (model LVS 300 Z, Welch).

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Mikroskopia fluorescencyjna i metody oparte o jej wykorzystanie

Mikroskopia fluorescencyjna jest odmianą mikroskopii świetlnej, która, ze względu na duże możliwości identyfikacji struktur sub-komórkowych, znalazła szerokie zastosowanie w naukach biologicznych, w tym w biologii komórki, cytofizjologii, lecz również genetyce, biochemii, biofizyce i biotechnologii. Działanie nowoczesnych mikroskopów fluorescencyjnych oparte jest na epifluorescenyjnym systemie optycznym, umożliwiającym detekcję i wizualizację sygnału pochodzącego od fluorochromu, tj. substancji zdolnej do emisji światła fluorescencyjnego po wzbudzeniu światłem o określonej długości. W układzie tym, światło wzbudzające fluorescencję próbki kierowane jest, poprzez system filtrów i luster, do wysokoaperturowego obiektywu, a następnie skupiane na preparacie. Wzbudzone światło fluorescencyjne wraca do obiektywu, a następnie kierowane jest do detektora obrazu, którym może być np. oko ludzkie, fotopowielacz lub kamera CCD/CMOS. Fluorochromy zawarte w analizowanych próbkach mogą być pochodzenia naturalnego (np. celuloza, chlorofil), jak również mogą być sztucznie wprowadzane do preparatów celem specyficznej wizualizacji określonych struktur sub-komórkowych lub niektórych procesów fizjologicznych. W tym drugim przypadku, wykorzystuje się m.in.:

  • fluorofory wykazujące powinowactwo do określonych organelli (np. DiI wiąże się specyficznie z błonami komórkowymi),
  • fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zależą od parametrów mikrośrodowiska, np. jego pH, lub stężenia jonów wapnia (Fluo-4, Fura-2);
  • fluorofory sprzężone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek (np. pochodna rodaminy sprzęgnięta z falloidyną, toksyną Ammanita phalloides, łączącą się specyficznie z F-aktyną;
  • fluorofory koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;
  • białka fluorescencyjne;
  • fluorochromy zdolne do przenikania przez złącza szczelinowe determinujące komunikację międzykomórkową, np. kalceinę.

Ponadto, mikroskopia fluorescencyjna umożliwia zastosowanie szerokiego wachlarza analiz ilościowych, w tym fotometrii. Badania oparte na analizach pojedynczych komórek uzupełniane mogą być analizami ilości i wewnątrzkomórkowej lokalizacji wybranych struktur na poziomie białka (Western Blot) i mRNA (RT-PCR).

W Zakładzie Biologii Komórki mikroskopię fluorescencyjną często wykorzystuje się do badania sygnalizacji jonowej, w szczególności do pomiarów sygnałów Ca2+ w czasie rzeczywistym. W zależności od zastosowanych sond wapniowych, sygnały Ca2+ można mierzyć nie tylko w cytozolu, ale także w innych kompartmentach komórkowych (np. retikulum endoplazmatyczne, mitochondria). Pomiary najczęściej wykonywane są w komorze perfuzyjnej przy stałym przepływie buforu zewnątrzkomórkowego z możliwością sekwencyjnej aplikacji związków chemicznych (aktywatorów / inhibitorów kanałów jonowych, testowanych leków itp.).