Przejdź do głównej treści

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

APARATURA:

Fluorescencyjny sorter komórkowy FACSAria III, Becton Dickinson

Sorter komórkowy BD FACSAria III (BD Bioscience) umożliwia wieloparametrową analizę komórek w oparciu o sygnał fluorescencyjny oraz parametry rozpraszania światła FSC i SSC, informujące odpowiednio o względnej wielkości i ziarnistości analizowanych obiektów. Urządzenie wyposażone jest trzy lasery: filetowy (405 nm), niebieski (488 nm) oraz czerwony (633 nm), umożliwiające jednoczesną detekcję 14 kanałów fluorescencji. Ponadto, sorter umożliwia nie tylko analizę cytometryczną, ale także sortowanie komórek w oparciu o cechy morfometryczne oraz znaczniki fluorescencyjne (FACS, ang. Fluorescence-activated cell sorting), na maksymalnie 4 strumienie do wielu typów naczyń (eppendorfy, probóki FACS, szalki hodowlane), z zastosowaniem dysz o różnej średnicy: 70 nm, 85 nm oraz 100 nm. Sorter wyposażony jest dodatkowo w moduł umożliwiający sortowanie komórek na płytki wielodołkowe oraz szkiełka mikroskopowe, z jednoczesną kontrolą termostatyczną. Ponadto, możliwe jest sortowanie pojedynczych komórek do celów klonowania. Dodatkowym wyposażeniem sortera BD FACSAria III jest system zabezpieczający, usuwający aerozole z komory sortującej.

Cytometria obrazowa ImageStream (ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer, Luminex Corp.)

Image Stream (Luminex Corp.) to unikatowa platforma, która łączy cechy klasycznego cytometru z mikroskopem fluorescencyjnym w jednym urządzeniu, Dzięki zastosowaniu kamer CCD, oprócz typowej analizy cytometrycznej uzyskuje się wysokorozdzielcze obrazy każdego analizowanego obiektu w jasnym i ciemnym polu oraz w kanałach fluorescencyjnych. Umożliwia to nie tylko jednoznaczne potwierdzenie czy interesujące nas obiekty są komórkami czy artefaktami, ale także prowadzenie zaawansowanych analiz morfometrycznych, badań kolokalizacji, translokacji, internalizacji i wielu innych. Zakład Biologii Komórki dysponuje systemem nowej generacji Image Stream X MkII, wyposażonym w 5 laserów, umożliwiając jednoczesną analizę obrazów komórek w 12 kanałach detekcji, w tym 9 kanałach fluorescencji. Aparat posiada również funkcję EDF (extended depth of field) pozwalającą na utrzymanie ostrości obrazu całej komórki, w odróżnieniu od pojedynczej powierzchni przekroju, co daje możliwość analiz FISH (fluorescence in situ hybridization) oraz innych, wymagających precyzyjnego liczenia pojedynczych zdarzeń w trójwymiarowej przestrzeni komórki. Aparat posiada także funkcję Multi-mag, z trzema zmienianymi automatycznie obiektywami (20x, 40x, 60x).

Integralną częścią systemu jest również oprogramowanie IDEAS, które umożliwia morfologiczną klasyfikację analizowanych obiektów w heterogennych próbkach, przy jednoczesnym generowaniu danych statystycznych dla wielotysięcznych populacji na podstawie co najmniej 80 cech dla każdego kanału detekcji (m.in. intensywności, powierzchni, średnicy, szerokości, wysokości, długości).

Klasyczna cytometria przepływowa (Guava EasyCyte, Merck)

Cytometr przepływowy Guava easyCyte 12 (Luminex Corp.) to nowoczesny, niewielkich rozmiarów aparat pozwalający na szybką analizę podstawowych parametrów komórek takich jak stężenie, żywotność, apoptoza czy analiza markerów powierzchniowych. Wyposażony jest w 3 lasery (niebieski, czerwony, fioletowy), umożliwiając detekcję sygnału w 10 kanałach fluorescencji.

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Metody cytometryczne

Cytometria przepływowa jest techniką badawczą, umożliwiającą wieloparametrową analizę komórek, w oparciu o ich właściwości morfologiczne oraz fenotypowe. Działanie cytometru opiera się na analizie wyznakowanych fluorescencyjnie obiektów poruszających się jeden za drugim w cienkim strumieniu cieczy, utworzonym dzięki tzw. fokusowaniu hydrodynamicznemu. Obiekty te przechodzą przez wiązki laserów, które wzbudzają obecne na nich fluorochromy. Wyemitowana w ten sposób fluorescencja jest następnie zbierana przez system detektorów i analizowana przez układ elektroniczny. Otrzymane w ten sposób dane prezentowane są w postaci histogramów lub wykresów kropkowych. W ten sposób możemy badać ekspresję zarówno markerów powierzchniowych, jak i wewnątrzkomórkowych, wyznakowanych odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami. Ponadto, światło laserów rozproszone na analizowanych obiektach daje nam informacje o ich względnej wielkości (parametr forward scatter- FSC),  jak i ziarnistości (parametr side scatter- SSC).
Współczesne kilkulaserowe cytometry przepływowe oraz wciąż poszerzająca się gama barwników fluorescencyjnych, umożliwiają jednoczesną analizę ekspresji kilkunastu antygenów jednocześnie. Ponadto technika ta umożliwia nie tylko analizę, ale również sortowanie wysokooczyszczonych frakcji komórek w oparciu o ich cechy morfologiczne oraz fenotyp (ang. fluorescence -activated cell storting, FACS).