Przejdź do głównej treści

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

APARATURA:

Mikroskop LEICA DMI6000B

Automatyczny mikroskop fluorescencyjny umożliwiający oprócz aplikacji opisanych dla mikroskopu Leica DM IRE2 również szybkie pomiary ratiometryczne oraz wykorzystanie technik FRET i TIRF.
W szczególności mikroskop posiada:

  • wyposażenie do fluorescencji, kontrastu IMC i DIC
  • obiektywy LD: 10x, 20x, 40x oraz oil: 40x, 63x, 100x
  • oświetlacz fluorescencyjny EL 6000
  • laser argonowy
  • stolik skanujący
  • inkubator typ BL z kontrolą CO2
  • w dwie cyfrowe chłodzone kamery CCD (12 bitowa Leica DFC360 FX i 14 bitowa  Hamamatsu 9100-02 EM-CCD High Speed Set)
  • system AF7000, dwumonitorowy z oprogramowaniem do dekonwolucji, obrazowania 3D, kolokalizacji sygnałów oraz analiz FRET, FURA2 i TIRF
  • stół antywibracyjny
  • filtry fluorescencyjne wąskopasmowe (cztery zestawy: A4; L5; N3; Y5)
  • filtr trójpasmowy :UV, niebieski, zielony, z wąskopasmowymi filtrami emisyjnymi:BP 465/20, BP 530/30 iBP 640/40 do układu IFW
  • wyposażenie do technik FRET i FURA2 oraz system do szybkiej akwizycji obrazu
  • wyposażenie do techniki TIRF

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Metody analizy aktywności migracyjnej komórek

Zdolność komórek zwierzęcych do aktywnej migracji jest od wielu lat przedmiotem badań licznych pracowni naukowych na świecie, ponieważ proces ten odgrywa istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych oraz jest związana z wieloma stanami patologicznymi. Aktywny ruch komórek ma miejsce między innymi w trakcie rozwoju embrionalnego, w procesie gojenia się ran, podczas reakcji obronnych układu odpornościowego oraz w trakcie wytwarzania przerzutów przez komórki nowotworowe. Zakład Biologii Komórki jest w pełni wyposażony w aparaturę oraz oprogramowanie umożliwiające rejestrację ruchu komórek oraz jego ilościową analizę.

Do rejestracji ruchu komórek wykorzystywane są systemy analizy obrazu składające się w każdym przypadku z mikroskopu, komory grzewczej, umożliwiającej utrzymanie temperatury 37°C, kamery cyfrowej i komputera wyposażonego w program do rejestracji poklatkowej obrazów. Nasze najbardziej zaawansowane mikroskopy są dodatkowo zmotoryzowane, co oznacza, że ich ruchomy stolik pozwala na rejestrację licznych pól widzenia w czasie jednego eksperymentu, zwiększając przepustowość opisywanych metod. Zastosowanie systemów komputerowych do badań migracji komórek opiera się m.in. na określaniu zmian położenia komórek w czasie doświadczenia.

Najczęściej stosowanym sposobem określania położenia komórki jest oznaczenie położenia jej środka geometrycznego. Do analizy trajektorii ruchu poszczególnych komórek wykorzystywany jest program Hiro (napisany przez W. Czaplę z przeznaczeniem do wykorzystania w Zakładzie Biologii Komórki). Trajektorie ruchu prezentowane są w postaci diagramów kołowych, w których początkowe punkty wszystkich trajektorii sprowadzone są do wspólnego początku znajdującego się w początku układu współrzędnych. Ilościowa analiza aktywności ruchowej komórek umożliwia wyznaczenie wielu parametrów ruchu między innymi:

 
  • całkowitego przemieszczenia komórek od punktu początkowego do końcowego położenia komórki;
  • całkowitej długości trajektorii ruchu komórek (trajektoria ruchu pojedynczej komórki jest sekwencją kolejnych odcinków, z których każdy odpowiada zmianie położenia centroidu komórki w określonym czasie);
  • średniej prędkości ruchu komórek liczonej z drogi całkowitej;
  • średniej prędkości migracji komórek liczonej z przemieszczenia;
  • współczynnika efektywności ruchu (CME), będącego stosunkiem wartości przemieszczenia do drogi rzeczywistej i określającego stopień persystencji ruchu komórek;
  • średniego kosinusa kierunkowego, określającego kierunkowość ruchu komórek względem określonej osi;
  • kątów intersegmentalnych pomiędzy poszczególnymi odcinkami trajektorii ruchu;
  • prędkości chwilowej komórek

Oprócz wyznaczania trajektorii do analizy ruchu komórek wykorzystuje się również metody oparte na analizie zmian kształtów migrujących komórek, czyli na analizie ich konturów i wyznaczaniu parametru określającego stosunek nowej powierzchni pokrytej przez wysuwające się w kierunku ruchu pseudopodium do powierzchni całkowitej komórki.

Alternatywnie do analiz ruchu pojedynczych komórek prowadzi się badania ruchu kolektywnego np. w teście zarastania ran in vitro (ang. wound-healing assay), gdzie korzystając z analogicznych układów mikroskopowych prowadzi się rejestrację poklatkową obrazu rysy wykonanej w monowarstwie komórek, w celu późniejszej analizy zmian jej powierzchni. Wykorzystuje się w tym celu przykładowo ogólnodostępne oprogramowanie ImageJ, wyposażone w dedykowane do analizy tego testu rozszerzenia.