Fizjologia komórek jest zależna od sygnałów (humoralnych lub mechanicznych), które aktywują odpowiednie receptory błonowe, a następnie kaskady sygnalizacyjne różnych białek. Niektóre z nich translokują do jądra komórkowego, a tam pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych dla wybranych genów. Zmiana ekspresji genów najczęściej przekłada się na zmiany w poziomach niektórych białek, regulując lub zmieniając właściwości i funkcje komórek. Metodami pozwalającymi na określenie zmian w poziomach ekspresji genów są np. Northern blotting (całkowity komórkowy materiał RNA jest początkowo rozdzielany w żelu agarozowym, a następnie cząsteczki RNA z żelu są przenoszone na nitrocelulozowe membrany i uwidaczniane za pomocą odpowiednich sond) lub Southern blotting (analizy DNA), a także techniki oparte o analizę liczby kopii mRNA w próbce RNA (np. mikromacierze oligonukleotydowe lub ilościowa RT-PCR). 

Ekspresję genów można analizować w komórkach w dowolnym punkcie czasowym (w czasie rzeczywistym) dzięki zastosowaniu metody real-time PCR (ilościowy PCR; ang. quantitative PCR, qPCR). W odróżnieniu od tradycyjnego PCR (zaproponowanego w latach osiemdziesiątych przez Kary’ego Banks’a Mullis’a), real-time PCR umożliwia analizę przyrostu produktów reakcji PCR po każdym cyklu reakcji, a nie wyłącznie po ostatnim. Ta nowoczesna metoda dzięki swojej specyfice stała się cennym narzędziem diagnostycznym z uwagi na wysoką czułość (umożliwia detekcję nawet jednej kopii badanego genu). Profil ekspresji genów w komórkach określany metodą real-time PCR wymaga wykorzystania matrycy, którą stanowi cDNA syntetyzowane z cząsteczek mRNA wyizolowanego z materiału biologicznego. Powielenie konkretnych sekwencji cDNA możliwe jest dzięki zastosowaniu specjalnych starterów (primerów), enzymów (termostabilnej polimerazy DNA) oraz barwnika interkalującego pomiędzy dsDNA lub sond fluorescencyjnych (np. SYBR Green, TaqMan, molecular beacons). Dzięki zapewnieniu odpowiednich warunków (np. temperatury, pH) sekwencje starterowe przyłączają się do odpowiadających im pod względem sekwencji jednoniciowych odcinków cDNA, a polimeraza dobudowuje nić komplementarną do wyjściowej matrycy. Określenie ilości danej sekwencji w próbce badanej jest możliwe za pomocą pomiarów fluorescencji zastosowanego barwnika. Reakcja qPCR obejmuje ok. 30-40 cykli złożonych z procesów: denaturacji podwójnych nici DNA (92–96°C), przyłączania starterów (annealing) oraz wydłużania nici (elongacja). W procesie denaturacji wiązania wodorowe są zrywane, po czym następuje rozdzielenie helisy DNA na pojedyncze nici, do których kolejno przyłączają się startery (o różnej temperaturze topnienia z zakresu 37–72°C). Wydłużanie nici zachodzi w temperaturze ok. 72°C od końca 3’ startera. Faza wstępna amplifikacji charakteryzuje się powolnym powielaniem produktu i znikomym sygnałem fluorescencyjnym emitowanym przez tło. Wyznaczana jest tzw. „linia bazowa” (baseline), która odpowiada fluorescencji w pierwszych cyklach reakcji PCR jeszcze przed wykryciem amplifikacji produktu. Wzrost stężenia amplikonów powoduje wzrost poziomu sygnału fluorescencyjnego aż do osiągnięcia wartości linii progowej (Ft, fluorescence treshold). Cykl, w którym dana próbka osiągnie poziom linii progowej, jest nazywany cyklem progowym – Ct (ang. Cycle Threshold). Od cyklu progowego rozpoczyna się faza logarytmiczna amplifikacji, którą cechuje podwojenie liczby kopii DNA w czasie każdego cyklu reakcji. Wtedy też sygnał fluorescencyjny pochodzący od barwników interkalujących pomiędzy dsDNA lub sond wzrasta i zostaje wyświetlony jako „wykres amplifikacji” (tzw. „amplification plot”). W tej fazie ilość kopii DNA wzrasta 2-krotnie w każdym cyklu, a takie zjawisko trwa aż do osiągnięcia fazy plateau. Jest to końcowa faza reakcji, w której obserwuje się zahamowanie reakcji wskutek zmniejszenia dostępnych cząsteczek polimerazy i/lub wykorzystania lub dezaktywacji substratów (np. 2'-deoksyadenozynotrójfosforany (dNTP) lub startery). Nagromadzone produkty powodują zmniejszenie efektywności amplifikacji aż do całkowitego zahamowania powielania DNA. Nie obserwuje się zmian w poziomie fluorescencji w kolejnych cyklach. Standardowo w reakcji real-time PCR wykorzystuje się kilka kontroli endogennych, których poziom ekspresji wyznaczany jako Ct służy do porównywania z Ct genu badanego. Kontrole endogenne to geny referencyjne, tzw. „housekeeping gene”, które ulegają transkrypcji w danym typie komórek na względnie stałym poziomie. Najczęściej stosowanymi kontrolami endogennymi są geny, pełniące ważne i podstawowe funkcje w komórce, np. GAPDH (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfo-glicerynowego) lub β-aktyna.