Skip to main content

Web Content Display Web Content Display

APARATURA:

Wysokorozdzielcza cytometria przepływowa dedykowana do analizy nanocząstek (Apogee A60-Micro-PLUS, Apogee Flow Systems)

System Apogee A60-Micro PLUS (Apogee Flow Systems) to unikatowy cytometr nowej generacji o wysokiej czułości i rozdzielczości, dedykowany do analiz małych cząstek, w tym w szczególności nanocząstek biologicznych. Wyposażony jest on w 2 lasery (488nm oraz 638nm), umożliwiające pomiar cząstek w 6 kanałach detekcji fluorescencji, dzięki czemu pozwala na wieloparametrowe fenotypowanie obiektów obecnych w analizowanych próbkach. Ponadto, posiada on także unikatowy system detektorów światła rozproszonego, zapewniający czułość niespotykaną w przypadku klasycznych cytometrów przepływowych, umożliwiającą detekcję cząstek o średnicy sięgającej nawet 80nm. Czyni to go tym samym optymalną platformą do analiz EVs.

Dodatkowym atutem jest także w system pobierania próbki przez mikro-strzykawkę, umożliwiający bezpośrednie zliczanie absolutnej liczby analizowanych cząstek, bez konieczności stosowania kulek referencyjnych.

Analizator stężenia oraz wielkości nanocząstek z wykorzystaniem techniki NTA (Nanosight NS300, Malvern)

Analizator nanocząstek NanoSight NS300 (Malvern Pananalytical) służy do wizualizacji oraz pomiaru wielkości nanocząstek, w tym w szczególności EVs, w zakresie od 10nm do 2 000nm w oparciu o ruchy Browna. Dzięki zastosowaniu trzech modułów laserowych oraz detektorów fluorescencji, aparat umożliwia również fenotypową ocenę nanocząstek, jak również analizę wielkości oraz stężenia nanocząstek o określonej ekspresji markera selekcyjnego.

Działanie aparatu opiera się na bezpośredniej detekcji i wizualizacji indywidualnych nanocząstek w zawiesinie. Cząstki poruszające się ruchami Browna są oświetlane wiązka lasera o określonej długości fali, a detekcja następuje przy udziale wbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego. W czasie analizy kamera o wysokiej rozdzielczości rejestruje film, na podstawie którego oprogramowanie oblicza współczynniki dyfuzji cząstek oraz ich średnice hydrodynamiczne, co przekłada się na informacje o rozmiarze, dystrybucji rozkładu i koncentracji cząstek. Jedną z zalet urządzenia jest możliwość jednoczesnego pomiaru intensywności i średnicy cząstek, co zapewnia poprawną analizę mieszaniny cząstek różnych typów oraz układów polidyspersyjnych.

Aparat wyposażony jest również w kontroler temperatury, pompę strzykawkową do dozowania próbki oraz komputer sterujący wraz z oprogramowaniem Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), zapewniającym dynamiczną wizualizację nanocząstek w czasie rzeczywistym, analizę każdej pojedynczej cząstki, zliczanie cząstek i analizę ich wielkości w postaci histogramów, jak również eksport danych do arkusza kalkulacyjnego i eksport zarejestrowanych filmów z analizy.

Ultrawirówka Optima XPN; Beckman Coulter

Ulrawirówka Optima XPN (Beckman Coulter) to najwyższej klasy nowoczesna ultrawirówka, dedykowana do izolacji nanocząstek biologicznych zarówno z pożywek jak i płynów ustrojowych. Umożliwia ona wirowanie płynów w kontrolowanych warunkach z prędkością sięgającą ponad 500 000 x g. Wyposażona jest ona zarówno w rotory stałokątowe, jak i wychylne, wraz z szeregiem adapterów, umożliwiających izolację preparatów z różnych objętości i z różną siłą peletowania. Wraz z pozostałą aparaturą będącą na wyposażeniu ZBK sprzęt ten umożliwia przeprowadzenie pełnego cyklu preparatyki i analizy materiału biologicznego pod kątem badań związanych z tematyką pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Web Content Display Web Content Display

Metody izolacji i analizy mikropęcherzyków pozakomórkowych (MVs)

Pęcherzyki pozakomórkowe (ang. extracellular vesicles; EVs) są̨ heterogenną grupą małych, obłonionych struktur, uwalnianych zarówno przez komórki prokariotyczne, jak i eukariotyczne, w tym komórki prawidłowe, nowotworowe, a także komórki macierzyste. Obecność EVs stwierdzono w wielu płynach ustrojowych człowieka: w tym w krwi, moczu, ślinie, nasieniu, płynie owodniowym oraz w medium kondycjonowanym z hodowli komórek in vitro.  Istnieje kilka metod izolacji pęcherzyków pozakomórkowych, a ich wybór jest ściśle związany z rodzajem materiału biologicznego stanowiącego źródło pęcherzyków. Najbardziej popularną techniką pozyskiwania pęcherzyków pozakomórkowych jest sekwencyjne wirowanie z etapem ultrawirowania. Początkowe etapy wirowania mają na celu usunięcie z materiału (np. pożywki) komórek, ich szczątków oraz większych ciałek apoptotycznych. Kolejnym krokiem jest ultrawirowanie przy min. 100 000 x g, którego efektem jest powstanie osadu, zawierającego frakcje zarówno ektosomów, jak i egzosomów. 

W ostatnich latach nastąpił intensywny rozwój nowych technik izolacji oraz oczyszczania próbek EVs. Modyfikuje się zarówno metodę sekwencyjnego wirowania, zmieniając parametry poszczególnych jego etapów, jak i optymalizuje się nowe techniki, w tym m.in. wirowanie w gradiencie sacharozy lub jodiksanolu, które wykorzystują subtelne różnice w gęstości poszczególnych frakcji. Stosuje się także metody kolumnowe, precypitacyjne, chromatograficzne, systemy do filtracji oraz komercyjnie dostępne zestawy do izolacji, oparte o strącanie EVs w glikolu polietylenowym. Ponadto, stosuje się również systemy bazujące o izolację poszczególnych populacji EVs w oparciu o kulki magnetyczne opłaszczone specyficznymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom stanowiącym markery poszczególnych typów pęcherzyków.