Skip to main content

Web Content Display Web Content Display

APARATURA:

Automatyczny mikroskop Leica DMI6000B wersja AF7000

Automatyczny mikroskop fluorescencyjny umożliwiający oprócz aplikacji opisanych dla mikroskopu Leica DM IRE2 również szybkie pomiary ratiometryczne oraz wykorzystanie technik FRET i TIRF.
W szczególności mikroskop posiada:

  • wyposażenie do fluorescencji, kontrastu IMC i DIC
  • obiektywy LD: 10x, 20x, 40x oraz oil: 40x, 63x, 100x
  • oświetlacz fluorescencyjny EL 6000
  • laser argonowy
  • stolik skanujący
  • inkubator typ BL z kontrolą CO2
  • w dwie cyfrowe chłodzone kamery CCD (12 bitowa Leica DFC360 FX i 14 bitowa  Hamamatsu 9100-02 EM-CCD High Speed Set)
  • system AF7000, dwumonitorowy z oprogramowaniem do dekonwolucji, obrazowania 3D, kolokalizacji sygnałów oraz analiz FRET, FURA2 i TIRF
  • stół antywibracyjny
  • filtry fluorescencyjne wąskopasmowe (cztery zestawy: A4; L5; N3; Y5)
  • filtr trójpasmowy :UV, niebieski, zielony, z wąskopasmowymi filtrami emisyjnymi:BP 465/20, BP 530/30 iBP 640/40 do układu IFW
  • wyposażenie do technik FRET i FURA2 oraz system do szybkiej akwizycji obrazu
  • wyposażenie do techniki TIRF

Fluorescencyjny sorter komórkowy FACSAria III, Becton Dickinson
Sorter komórkowy BD FACSAria III (BD Bioscience) umożliwia wieloparametrową analizę komórek w oparciu o sygnał fluorescencyjny oraz parametry rozpraszania światła FSC i SSC, informujące odpowiednio o względnej wielkości i ziarnistości analizowanych obiektów. Urządzenie wyposażone jest trzy lasery: filetowy (405 nm), niebieski (488 nm) oraz czerwony (633 nm), umożliwiające jednoczesną detekcję 14 kanałów fluorescencji. Ponadto, sorter umożliwia nie tylko analizę cytometryczną, ale także sortowanie komórek w oparciu o cechy morfometryczne oraz znaczniki fluorescencyjne (FACS, ang. Fluorescence-activated cell sorting), na maksymalnie 4 strumienie do wielu typów naczyń (eppendorfy, probóki FACS, szalki hodowlane), z zastosowaniem dysz o różnej średnicy: 70 nm, 85 nm oraz 100 nm. Sorter wyposażony jest dodatkowo w moduł umożliwiający sortowanie komórek na płytki wielodołkowe oraz szkiełka mikroskopowe, z jednoczesną kontrolą termostatyczną. Ponadto, możliwe jest sortowanie pojedynczych komórek do celów klonowania. Dodatkowym wyposażeniem sortera BD FACSAria III jest system zabezpieczający, usuwający aerozole z komory sortującej.

Web Content Display Web Content Display

Metody analizy komunikacji międzykomórkowej

Intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych analizowana jest za pomocą modelu opartego na pomiarze przepływu barwnika fluorescencyjnego kalceiny między komórkami donorowymi a populacją komórek akceptorowych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. W metodzie tej, pojedyncze komórki donorowe (obładowane barwnikiem) wysiewane są na monowarstwę komórek akceptorowych. Jeśli daną populację komórek cechuje obecność funkcjonalnych złączy szczelinowych, następuje międzykomórkowy transfer barwnika między komórką donorową, a komórką akceptorową i dalej do sąsiednich komórek akceptorowych. Szybkość rozchodzenia się barwnika między komórkami akceptorowymi, którą można analizować technikami fotometrycznymi lub cytometrii przepływowej, określana jest jako stosunek liczby komórek akceptorowych zawierających barwnik do liczby komórek donorowych i do ogólnej liczby komórek w populacji. Więcej o metodach analizy komunikacji międzykomórkowej można przeczytać w artykule naukowym: Czyż J, Irmer U, Schulz G, Mindermann A, Huelser DF. (2000). Gap-junctional coupling measured by flow cytometry. Exp Cell Res, 255(1):40-6.