Przejdź do głównej treści

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

APARATURA:

Komora elektrotaktyczna

W badaniach elektrotaksji stosowany jest układ pozwalający na kontrolowane aplikowanie pola elektrycznego prądu stałego (przedstawiony na załączonym schemacie). Na układ składa się szklana komora obserwacyjna, do której wprowadzane są badane komórki. Jest ona montowana w większej komorze z tworzywa sztucznego, która jest wyposażona w elektrody chloro-srebrowe umieszczone w zewnętrznych kompartmentach, do których podłączony jest zasilacz, oraz amperomierz. Wewnętrzne są z kolei wypełnione pożywką hodowlaną, która swobodnie przepływa przez wnętrze szklanej komory obserwacyjnej. Znajdują się w nich dodatkowo srebrowe elektrody pomiarowe, które wraz z podłączonym woltomierzem pozwalają na ciągły monitoring natężenia stosowanego pola elektrycznego. Łączność między kompartmentami zapewniają szklane klucze elektrolityczne wypełnione agarem, które dodatkowo wychwytują szkodliwe produkty uboczne pracy elektrod chloro-srebrowych.
Schemat komory: (Zimoląg, 2016)

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Badania fizjologii komórek w polu elektrycznym

Komórki biorące udział w takich procesach biologicznych jak embriogeneza, gojenie ran i regeneracja tkanek bardzo często muszą wykazywać zdolność do kierunkowej migracji w celu dotarcia do tych miejsc organizmu, w których mają wypełnić swoje funkcje biologiczne. Jednym z licznych przykładów takiej aktywności może być migracja komórek w kierunku wzrastającego stężenia chemoatraktanta w obrębie tkanki w trakcie procesu gojenia ran. Nie jest to jedyny znany mechanizm naprowadzania kierunkowego migrujących w czasie tego procesu komórek. Wiadomo, że komórki mogą również odpowiadać kierunkową migracją na inne bodźce. Jednym z pierwszych kierunkowych sygnałów, który pojawia się natychmiast po zranieniu jest stałe pole elektryczne. Obecność endogennych pól elektrycznych (PE) w przestrzeni zewnątrzkomórkowej była po raz pierwszy stwierdzona już ponad 150 lat temu, jednakże ich znaczenie dla licznych procesów fizjologicznych zostało potwierdzone dopiero w ostatnim czasie, w wyniku zastosowania wielu nowoczesnych metod badawczych. Kilka niezależnych prac potwierdziło, że pola elektryczne są formowane we wszystkich rozwijających się i regenerujących tkankach zwierzęcych i odgrywają istotną rolę w kluczowych procesach biologicznych, takich jak embriogeneza, gojenie ran i regeneracja tkanek. Większość organów i zarodków otoczonych przez warstwę komórek nabłonkowych wytwarza potencjał transepitelialny rzędu od kilku do kilkudziesięciu miliwoltów. Głównym efektem działania PE na poziomie komórkowym jest elektrotaksja, czyli kierunkowa migracja w kierunku katody lub anody. Warto zwrócić uwagę, że taka aktywność ruchowa jest zupełnie odmienna od pasywnego przemieszczenia nieożywionych cząsteczek pod wpływem czysto fizycznych oddziaływań, gdyż komórki odpowiadają na pole elektryczne aktywną kierunkową migracją.

Pola elektryczne o natężeniu zbliżonym do obserwowanego in vivo aplikowane w warunkach in vitro indukują elektrotaksję licznych typów komórek. Jednakże, pomimo wieloletnich badań, wciąż nieznany pozostaje mechanizm wykorzystywany przez komórki do detekcji tak niewielkich pól elektrycznych i kierunkowej migracji w odpowiedzi na ich obecność. Do chwili obecnej zaproponowano kilka potencjalnych mechanizmów reakcji elektrotaktycznej. Jednak żaden z nich nie tłumaczy w pełni wszystkich poczynionych obserwacji dotyczących przebiegu tego zjawiska. W szczególności żaden pojedynczy sensor PE wykorzystywany w elektrotaksji nie został poznany. Jednym z możliwych powodów takiego stanu rzeczy może być brak takiego pojedynczego sensora i dwu- lub wielomodalny charakter reakcji elektrotaktycznej. Dwie główne hipotezy wyjaśniające mechanizm elektrotaksji opierają się bądź na mechanizmie zakładającym aktywację specyficznych kanałów jonowych przez pole elektryczne, bądź redystrybucję zlokalizowanych na powierzchni komórki błonowych receptorów odpowiedzialnych za reakcję na kierunkowe sygnały pochodzące od chemokin lub czynników wzrostowych.

Celem przybliżenia mechanizmu odpowiedzialnego za elektrotaksję, w ZBK prowadzone są badania polegające na rejestrowaniu ruchu komórek umieszczonych w precyzyjnie kontrolowanym polu elektrycznym prądu stałego (z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanego do tego układu), przy użyciu mikroskopii w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjnej. W tym drugim przypadku możliwe jest obrazowanie redystrybucji białek błonowych sprzęgniętych z białkami fluorescencyjnymi, oraz biosensorów wykazujących aktywację poszczególnych szlaków sygnałowych w odpowiedzi na aplikowane pole elektryczne. W uzasadnionych przypadkach selektywność obrazowania może być ściśle ograniczona do błony komórkowej, poprzez zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM).

Prowadzone są też modyfikacje komórek polegające na obniżeniu ekspresji wybranych białek, głównie z grupy kanałów jonowych. Obserwowana jest również odpowiedź elektrotaktyczna komórek w obecności inhibitorów selektywnie hamujących aktywność poszczególnych receptorów błonowych lub szlaków sygnałowych. Badania prowadzone w naszej grupie wyróżnia duży nacisk kładziony na dynamikę odpowiedzi elektrotaktycznej, a także analizy dotyczące komórek wykazujących zróżnicowaną strategię ruchu.